A hemoglobina livre no plasma (HLP) é um importante biomarcador em diversas condições médicas, como doenças cardiovasculares, renais e hematológicas. Apesar de sua relevância clínica, a quantificação exata da HLP tem sido um desafio devido à falta de técnicas sensíveis e específicas. Este estudo apresenta uma nova técnica para a quantificação da HLP baseada no uso da espectrofotometria de microvolume, que demonstrou excelente desempenho analítico, permitindo medições confiáveis em amostras de plasma, mesmo na presença de substâncias interferentes. O estudo de regressão linear simples a 415 nm apresentou uma inclinação de 0,0840 mg/dL, uma ordenada na origem de 0,4288 e um coeficiente de determinação de 0,9616. A inexatidão para 5 mg/dL foi de 4,84 mg/dL e para 20 mg/ dL, de 19,14 mg/dL. O erro analítico total foi de 14,60% para 5 mg/dL e de 12,27% para 20 mg/dL. A recuperação analítica foi de 99,96% para 5 mg/dL e de 98,1267% para 20 mg/dL. Os limites de detecção e quantificação foram de 1,61 mg/dL e 3,22 mg/dL, respectivamente. Os valores de referência para os pacientes estudados variaram entre 7,84 e 9,73 mg/dL. Sua validação em uma ampla gama de condições fisiológicas e patológicas permite que seja reconhecida como uma técnica robusta e versátil. Este novo método é preciso, sensível e específico, com desempenho comparável ou superior ao dos métodos tradicionais. Pode ser aplicado com apenas uma gota de plasma, sendo ideal para pacientes pediátricos. Detecta eficazmente interferências de lipídios e bilirrubina. Embora tenha limitações em termos de capacidade de processamento e custo elevado, é considerado robusto e clinicamente útil para o diagnóstico e acompanhamento de patologias associadas à hemólise. Representa um avanço significativo na quantificação da HLP em ambientes clínicos e de pesquisa.