El objetivo del trabajo fue comparar dos métodos de determinación de aminotransferasas con y sin agregado de fosfato de piridoxal (PLP). Se encontró que los datos no siguieron la distribución normal (p>0,05); que la diferencia entre las medias fue estadísticamente significativa (p<0,0001) y que la relación fue lineal positiva (r>0,967, p<0,0001). La concordancia fue del 95% para la aspartato aminotransferasa (AST) y 93-94% para la alanina aminotransferasa (ALT). La variación de actividad con PLP fue para ALT: 11,13 UI/L (IC95%: 7,99-14,28), 6,44 UI/L (IC95%: 4,35-8,52) y 8,76 UI/L (IC95%: 6,85-10,67) y para AST: 10,86 UI/L (IC95%: 4,63-17,08), 8,08 UI/L (IC95%: 5,06-11,10) y 9,36 UI/L (IC95%: 6,12-12,61) para hombres, mujeres y ambos sexos, respectivamente. En conclusión, se demostró que con el PLP se sobreestimó la actividad de ambas enzimas.
Palabras clave: Alanina aminotransferasa; ALT; Aspartato aminotransferasa; AST; Comparación de métodos; Passing Bablok; Bland Altman
Comparison of two methods with and without the addition of pyridoxal phosphate for the determination of aminotransferase activity
The work aimed to compare two methods of determining aminotransferases with and without adding pyridoxal phosphate (PLP). It was found that the data did not follow the normal distribution (p>0.05); that the difference between means was statistically significant (p<0.0001) and that the relationship was positive linear (r>0.967, p<0.0001). The agreement was 95% for aspartate aminotransferase (AST) and 93-94% for alanine aminotransferase (ALT). The variation of ALT activity with PLP was: 11.13 IU/L (95%CI: 7.99-14.28), 6.44 IU/L (95%CI: 4.35-8.52) and 8.76 IU/L (95%CI: 6.85- 10.67) and the variation of AST was: 10.86 IU/L (95%CI: 4.63-17.08), 8.08 IU/L (95%CI: 5.06-11.10) and 9.36 IU/L (95%CI: 6.12-12.61) for men, women and both sexes, respectively. In conclusion, it was shown that PLP overestimated the activity of both enzymes.
Keywords: Alanine aminotransferase; ALT; Aspartate aminotransferase; AST; Comparison of methods; Passing Bablok; Bland Altman
Comparação de dois métodos com e sem o acréscimo de fosfato de piridoxal para a determinação de atividade de aminotransferases
O objetivo do trabalho foi comparar dois métodos de determinação de aminotransferases com e sem acréscimo de fosfato de piridoxal (PLP). Verificou-se que os dados não seguiram a distribuição normal (p>0,05); que a diferença entre as médias foi estatisticamente significativa (p<0,0001) e que a relação foi linear positiva (r>0,967, p<0,0001). A concordância foi de 95% para aspartato aminotransferase (AST) e 93%-94% para alanina aminotransferase (ALT). A variação de atividade com PLP foi ALT: (11,13 UI/L (IC95%: 7,99-14,28), 6,44 UI/L (IC95%: 4,35-8,52) e 8,76 UI/L (IC95%: 6,85-10,67) e AST: 10,86 UI/L (IC95%: 4,63-17,08), 8,08 UI/L (IC95%: 5,06-11,10) e 9,36 UI/L (IC95%: 6,12-12,61) para homens, mulheres e ambos os sexos, respectivamente. Em conclusão, foi demonstrado que o PLP superestimou a atividade de ambas as enzimas.
Palavras-chave: Alanina aminotransferase; ALT; Aspartato aminotransferase; AST; Comparação de métodos; Passing Bablok; Bland Altman
La importancia clínica de la actividad de las aminotransferasas se ha estudiado desde mediados del siglo XX en las enfermedades del tejido cardíaco, hepático y del músculo esquelético. Se ha visto que su presencia en la circulación sanguínea se encuentra relacionada al daño tisular (1).
En la actualidad se conocen dos aminotransferasas que presentan aplicación clínica: la alanina aminotransferasa (ALT, EC 2.6.1.2) y la aspartato aminotransferasa (AST, EC 2.6.1.1). Su principal utilidad en medicina se relaciona con el diagnóstico, seguimiento, tratamiento y evolución de las patologías del tracto gastrointestinal; por ejemplo: colecistitis aguda, coledocolitiasis, tumor de vías biliares, hepatitis secundarias a virus hepatotropos (A, B, C, D, etc., citomegalovirus y Epstein-Barr), histoplasmosis, hígado séptico, etc. Además, se ha visto que el valor del índice De Ritis –cociente entre el valor de la actividad de AST y ALT– se considera de gran utilidad en situaciones clínicas en las que se necesita conocer el origen del daño inflamatorio o hepatocelular. En el caso particular de la AST, se pueden detectar aumentos de actividad en otros cuadros clínicos de origen extrahepático, por ejemplo: infarto agudo de miocardio, distrofias musculares y miopatías inflamatorias y tóxicas (2) (3).
En el laboratorio de análisis clínicos, la determinación de las aminotransferasas se realiza cotidianamente y los procedimientos analíticos que se emplean para medir su actividad se fundamentan en los principios de la cinética enzimática. Se ha estudiado que establecer las condiciones óptimas para su medición posibilita la validación y la emisión de resultados clínicamente útiles. Actualmente, no se ha podido lograr un acuerdo acerca de la incorporación al buffer sustrato de fosfato de piridoxal (PLP, vitamina B6), si bien su uso se considera necesario para lograr la actividad enzimática, ya que éste constituye el verdadero transportador de electrones en las reacciones de transaminación. Sin embargo, en aquellos individuos con déficit de esta vitamina (cirrosis, alcoholismo crónico, gerontes, etc.) se ha recomendado su uso (4) (5).
Con respecto a las funciones que se incluyen en la gestión del laboratorio clínico se encuentra el aseguramiento de la calidad. En este último se debería incluir la comparación de los métodos analíticos a fin de garantizar la precisión y confiabilidad de los resultados. En general, se ha visto que la selección del método analítico adecuado mejora la calidad del diagnóstico médico (6) (7) (8).
La aplicación de los modelos de regresión lineal se utiliza con el fin de establecer la relación entre la concentración del analito y la respuesta del método. La estimación estadística de los parámetros de regresión se considera útil en el análisis cuantitativo, particularmente, en la construcción de las curvas de calibración. También, a partir de la interpretación de los datos que éstos proporcionan, se puede comprender el comportamiento del método.
Dentro de los parámetros de regresión se incluyen: la pendiente, la ordenada al origen y el coeficiente de correlación. Mediante el estudio de la pendiente se puede representar la sensibilidad del método. En cambio, la respuesta del método en ausencia del analito se observa al analizar los valores que adquiere la ordenada al origen y la fuerza de la relación lineal entre la actividad en ambos métodos se estima por medio del coeficiente de correlación. Ésta se considera fuertemente positiva o negativa cuando su valor se acerca a 1 o -1, respectivamente.
Por otra parte, la información de la precisión de la estimación se puede obtener a partir del conocimiento del intervalo de confianza (IC95%) del parámetro de regresión.
Los modelos de Passing Bablok, de Deming y de los cuadrados mínimos se han propuesto en las normativas del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) junto al diagrama de Bland Altman con el fin de realizar el análisis de regresión y de concordancia para la comparación metodológica (9) (10) (11) (12) (13).
El propósito del presente trabajo fue comparar los métodos de la Federación Internacional de Química Clínica y Medicina del Laboratorio (IFCC) para determinar la actividad de ALT y AST con y sin la adición de PLP, así como establecer y evaluar las diferencias entre ambos.
Se realizó un estudio descriptivo, observacional, retrospectivo y de corte transversal.
Población
Se tomaron muestras séricas de individuos de ambos sexos, ambulatorios e internados, que concurrieron al laboratorio central del Hospital de Clínicas “José de San Martín” durante los meses de julio y agosto de 2024.
Criterios de inclusión
Pacientes mayores de 18 años de ambos sexos, que se realizaron la extracción de sangre en el laboratorio central del Hospital de “Clínicas José de San Martín” en el período comprendido entre los meses de julio y agosto de 2024, a los que se les solicitó la determinación de actividad de ALT y AST.
Criterios de exclusión
Muestras séricas que presentaron índice de hemólisis, de lipemia y de ictericia que superaran los valores establecidos como interferentes metodológicos (4) (5).
La toma de las muestras de sangre periférica se realizó respetando las normas bioéticas del citado nosocomio con garantía de anonimato y confidencialidad de los participantes.
Según lo declarado por los fabricantes, para el método Roche con y sin PLP, el rango de linealidad es de 5 a 700 UI/L tanto para AST como para ALT. Se aplicaron las normativas que se establecen en la guía EP09 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (11) y se seleccionó el intervalo de actividad enzimática de la siguiente manera: (A) por debajo de la mitad del límite superior de referencia (LSVR): 8 muestras; (B) entre LSVR/2 y LSVR: 24 muestras; (C) entre 2 veces el LSVR y 4 veces el LSVR: 4 muestras y (D) entre 4 veces el LSVR y el límite superior del intervalo de linealidad proporcionado por el fabricante (Roche Diagnostics®): 4 muestras. Luego, se clasificaron en cuatro grupos: A, B, C y D, respectivamente (Tabla I) (11). La actividad enzimática se expresó en UI/L (unidades internacionales por litro de líquido biológico).
Se utilizó el método recomendado por la IFCC con y sin el agregado de PLP para determinar la actividad de ALT y AST. Se usó el reactivo ALTL y ASTL sin piridoxal COBAS (Roche Diagnostics®) y el reactivo ALTP2 y ASTP2 con piridoxal COBAS (Roche Diagnostics ®). Los valores de referencia para el método IFCC sin PLP fueron de hasta 31 UI/L y hasta 40 UI/L para mujeres y hombres, respectivamente (4) (5). Este último se utilizó como método de referencia.
Se usaron los espectrofotómetros de longitud de onda múltiple COBAS c 501 (Roche Diagnostics®, Alemania) y COBAS pro c 503 (Roche Diagnostics®, Suiza) como instrumentos de medida. En el primero se empleó el método sin agregado de PLP y en el segundo se utilizó el método con agregado de PLP.
Se calculó la diferencia relativa porcentual (DRP) como el cociente entre la diferencia de la actividad determinada con y sin PLP y la actividad medida por el método sin PLP por 100 según la siguiente ecuación:
Se utilizaron las pruebas estadísticas de Shapiro-Wilk y de Kolmogorov-Smirnov para evaluar la normalidad de la distribución.
Se aplicó la prueba t de Student pareada para la comparación de las medias con un nivel de significación menor del 5% de error (p<0,05).
Se calculó el coeficiente de correlación de Spearman (r), se realizó el análisis de regresión de Passing Bablok (10) y el de concordancia de Bland y Altman (12) (13). Se emplearon los programas estadísticos RStudio (Versión 2024.04.2) y SPSS (Versión 25, IBM Corp.).
Al analizar las pruebas estadísticas de Shapiro-Wilk y de Kolmogorov-Smirnov se encontró que el conjunto de datos se desvió significativamente de la distribución normal (p<0,001), por lo tanto, los datos se expresaron como mediana (mínimo y máximo). Además, se realizó la prueba t de Student para ALT y AST en ambos sexos y se obtuvo un valor p<0,001; los datos se expresaron como media y desvío estándar (Tabla II).
Se realizó el análisis de regresión lineal de Passing-Bablok y se valoró la ecuación de la recta (y = ax + b), el coeficiente de correlación de Spearman (r) y el nivel de significación para cada una de las enzimas según el sexo (Tabla III) (Fig. 1) (Fig. 2). En relación a la ecuación de la recta se observó que los intervalos de confianza (IC95%) de la pendiente (a) y de la ordenada en el origen (b) para ambos sexos, no incluyeron los valores teóricos respectivos de 1 para la a y de 0 para la b en el caso de ALT. En cambio, para AST, el IC95% de a no incluyó el valor 1, mientras que el IC95% de b incluyó el valor 0, en ambos sexos sexos (Fig. 1) (Fig. 2). Con respecto al r, en ambas enzimas y para ambos sexos fue superior a 0,967 (p<0,0001). Además, se encontró que el valor fue mayor en las mujeres con respecto al de los hombres para ALT (Fig. 1A) (Fig. 1B), mientras que para AST resultó a la inversa. También, se observó que el r fue mayor para ALT cuando se lo comparó con el de AST (Fig. 2A) (Fig. 2B) en el caso de analizar ambos sexos en conjunto.
En el diagrama de dispersión de Bland Altman se graficó la diferencia entre las actividades que provinieron de los métodos con y sin agregado de PLP (eje Y) y la media de las determinaciones por ambos métodos (eje X). Además, se identificó el valor medio de las diferencias entre los métodos (m) y los límites de acuerdo superior e inferior (m ± 1,96 DE) (Fig. 3) (Fig. 4). Se mostró que el 93,20% (Fig. 3A), el 93,18% (Fig. 3B) y el 93,10% (Fig. 3C) de los datos se ubicó dentro del rango aceptable para ALT en hombres, mujeres y en ambos sexos, respectivamente. Por el contrario, en el caso de la AST, los resultados fueron del 95,24% (Fig. 4A), 95,92% (Fig. 4B) y 96,72% (Fig. 4C), respectivamente. Además, se halló que el valor medio de las diferencias fue distinto de cero y que el IC95% de la media de la diferencia entre métodos no incluyó ese valor cuando se evaluaron las dos enzimas para ambos sexos.
Con respecto a la ALT, la diferencia media fue de 11,13 UI/L (IC95%=7,99-14,28) para hombres (Fig. 3A); 6,44 UI/L (IC95%=4,35-8,52) para mujeres (Fig. 3B) y de 8,76 UI/L (IC95%=6,85-10,67) para ambos sexos (Fig. 3A), respectivamente. Mientras que los límites de acuerdo inferior y superior se encontraron en -8,90 y 31,16; -6,99 y 19,87; y -8,78 y 26,30 para hombres (Fig. 3A), mujeres (Fig. 3B) y en ambos sexos (Fig. 3C), respectivamente.
En referencia a la AST, en hombres la diferencia media fue de 10,86 UI/L (IC95%=4,63-17,08) y los límites de acuerdo inferior y superior se encontraron en -28,30 y 50,02 (Fig. 4A). En mujeres, fue de 8,08 UI/L (IC95%=5,06-11,10) y los límites de acuerdo inferior y superior fueron -12,50 y 28,66 (Fig. 4B). Mientras que para ambos sexos, fue de 9,36 UI/L (IC95%=6,12- 12,61) y los límites de acuerdo inferior y superior fueron -21,16 y 39,88 (Fig. 4C).
La diferencia relativa porcentual entre los métodos (DRP) y el IC95% se graficó en función de la actividad de cada enzima medida con el método sin PLP (Fig. 5) (Fig. 6). En A, B y C se observó una recta con tendencia negativa que se hace menor a medida que aumenta la actividad enzimática.
La comparación de los métodos IFCC permitió evaluar el comportamiento del procedimiento de medida del método que incluyó el agregado de PLP en el sustrato con respecto al que no lo contenía.
Se seleccionó el intervalo de valores de actividad enzimática de acuerdo con la propuesta en la guía EP09 del CLSI (11) debido a que se conoce que el valor de r es sensible a esta elección y que cuanto más amplio se elige el rango de valores, mayor será la significación estadística de r (14).
Se determinó que la distribución de los datos no cumplió con los criterios de normalidad (p<0,0001) ya que se obtuvo un valor de p menor que el nivel de significación (p>0,05).
Se calculó el valor de r y se observó que fue superior a 0,90 en todos los casos (r>0,967, p<0,0001). Esto indicó que existe un fuerte grado de asociación positiva lineal entre los métodos y que los puntos se ubicaron muy cerca de una línea recta de pendiente creciente.
Con respecto al análisis de regresión lineal de Passing-Bablok, en base a las pruebas de hipótesis propias del método de regresión, se identificó que la diferencia entre métodos se conformó por el componente constante y el proporcional para ALT cuando se consideraron ambos sexos. En cambio, se detectó que el aporte fue debido al componente proporcional en el caso de la AST (10).
Si bien el estudio del r y del análisis de regresión permitió describir la relación lineal de los pares de datos, no fue posible conocer el grado de concordancia entre los métodos mediante su aplicación. Se ha visto que obtener un elevado grado de correlación no implica, necesariamente, la existencia de un alto grado de acuerdo.
Por otro lado, el estudio del valor de t se asoció a la probabilidad de que las medias de las actividades no fuesen iguales y posibilitó valorar el conjunto de los resultados. En este trabajo, se obtuvo un valor p<0,0001 en la prueba t. Este dato indicó la existencia de una diferencia sistemática estadísticamente significativa entre las medias de las actividades obtenidas que resultaron de la aplicación de los métodos con y sin PLP para las dos enzimas y en ambos sexos (15).
En relación al análisis de Bland Altman, fue posible analizar el comportamiento del valor de la diferencia entre las actividades medidas por ambos métodos en función de su valor medio. La interpretación de los resultados permitió observar concordancia sólo para AST ya que los datos que se encontraron dentro de los límites de acuerdo superior e inferior fueron mayores del 95% y se conoce que este porcentaje constituye un requisito indispensable para definir concordancia entre métodos. En contraste, el porcentaje se ubicó entre el 93% y 94% para ALT. Por otra parte, al analizar el valor medio de las diferencias y el del IC95% se observó que fueron distintos de cero para cada una de las enzimas y que la diferencia sistemática de unidades de actividad enzimática fue estadísticamente significativa y superior, en promedio, cuando se usó el método con PLP. También se trazó la línea de regresión de las diferencias que demostró la presencia de una tendencia positiva en todos los casos. Se observó que la diferencia fue absoluta y tomaba valores mayores a medida que aumentaba la actividad enzimática. Es decir, ésta se incrementó y se modificó en forma directamente proporcional al aumentar la actividad de las enzimas (Fig. 3) (Fig. 4). Al evaluar la DRP y analizar la línea de tendencia, se observó que la discordancia fue mayor en actividades de ALT y AST menores (Fig. 4) (Fig. 5).
Hasta la fecha, en la Argentina no se han publicado estudios de comparación entre estas metodologías. Adicionalmente, la implementación de la adición de PLP en Latinoamérica no ha alcanzado una difusión adecuada a nivel regional. Si bien Plebani y colaboradores han abordado este tema desde la década de los setenta, resultaría recomendable que tanto las empresas fabricantes de los reactivos como los laboratorios de análisis clínicos consideraran la evaluación del desempeño del método con PLP (16).
La comparación de métodos es una práctica habitual y necesaria en el laboratorio, especialmente al cambiar de metodología (11). El uso de dos autoanalizadores se podría considerar una limitación del estudio. No obstante, el COBAS pro c 503 (Roche Diagnostics®, Suiza) que se incorporó al laboratorio en reemplazo del COBAS c 501 (Roche Diagnostics®, Alemania) sólo procesa muestras con el método IFCC con PLP.
En conclusión, los resultados del estudio demostraron que las actividades de ALT y AST proporcionadas por ambos métodos no son intercambiables debido a que el método IFCC con el agregado de PLP podría sobreestimar la actividad de las aminotransferasas.
El presente trabajo fue realizado sin haberse recibido una financiación específica.
Las autoras declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.
Bioq. VIVIANA MÓNICA YAPUR
(C1120AAR) Av. Córdoba 2351. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina. Departamento de Bioquímica Clínica. Hospital de Clínicas “José de San Martín”. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires.
Correo electrónico: vmyapur@ffyb.uba.ar
Recibido: 16 de abril de 2025
Aceptado: 14 de noviembre de 2025